Caracterització funcional de les causes genètiques de pacients amb malalties metabòliques hereditàries i Parkinson

Abstract

El diagnòstic de malalties minoritàries (MM) denominades rares, tals com són les malalties metabòliques hereditàries, és un procés complex que implica una acurada caracterització clínica i bioquímica dels pacients per encaminar aquest diagnòstic en base d’una sèrie d’estudis genètics, moleculars i bioquímics. La seqüenciació genètica és una eina primordial en el context del diagnòstic genètic i molecular de les ja esmentades condicions rares. Durant els últims 10 anys, la seqüenciació genètica ha esdevingut relativament més fàcil, de menys cost i considerablement més àgil amb l’aparició de Next Generation Sequencing (NGS). Mitjançant NGS es poden identificar mutacions que donen lloc a malaltia o que n’atorguen susceptibilitat. Els objectius del present treball han estat la validació genètica i funcional de les variants identificades per Next Generation Sequencing (NGS) en malalties metabòliques hereditàries i en la malaltia de Parkinson. En cas de tenir-se molt clar el gen com en el cas dels pacients amb Parkinson, s’ha realitzat PCR i Sanger establint així el diagnòstic definitiu. En cas de no tenir aquesta certesa, s’ha procedit a la seqüenciació de l’exoma (part del ADN que codifica per proteïna) dels pacients, el filtratge de les variants i la validació d’aquestes amb estudis funcionals. Aquests estudis funcionals han estat específics de cada cas i han implicat l’ús de mètodes de biologia molecular (PCR, qPCR, Extracció de ARN, Síntesi de ADNc, western blot, blue native, activitats enzimàtiques en gel i transfecció) i cel·lular (cultius de fibroblasts de pacients). A partir dels resultats obtinguts s’han pogut validar funcionalment les mutacions identificades en els gens FDXR i NDUFS2. D’altre banda s’han descartat les variants presents en els gens NPHP4 i GMDS. Pel que fa als pacients amb Parkinson, s’han descartat totes les variants trobades en baixa cobertura en el gen ATP13A2. Això ens reitera que s’han de comprovar sempre aquelles variants que es trobin en baixos valors de cobertura en estudis de NGS. D’altre banda, s’ha trobat una variant en el gen PLA2G6 en el germà d’un dels pacients portadors de la variant. Aquests diferents estudis ens mostren la importància de l’especificitat d’ aquests en funció de cada cas. Aquells estudis que han validat les variants ens permeten arribar a un diagnòstic definitiu.

The diagnosis of minority diseases (MM) also called rare diseases, such as hereditary metabolic diseases, is a complex process that involves a careful clinical and biochemical characterisation of patients to route this diagnosis on the basis of a series of molecular, biochemical and genetic studies. The genetic sequencing is a primordial tool in the context of genetic and molecular diagnosis of the rare conditions already mentioned. During the last 10 years, the genetic sequencing has become relatively easier, less expensive and considerably more agile with the emergence of Next Generation Sequencing (NGS). By NGS we can identify mutations that give rise to a particular disease or also to its susceptibility. The objectives of the present study have been the genetic and functional validation of the variants identified by Next Generation Sequencing (NGS) in hereditary metabolic disorders and in Parkinson's disease: In the case in which we had clear the gene, such as in case of Parkinson's disease patients, PCR and Sanger have been carried on establishing the final diagnosis. On the other hand, it has been done the exome sequencing (the protein codifying part of the DNA) of the patients, filtering of the variants and the validation of those with functional studies. These functional studies have been specific to each case and have involved the use of methods of molecular biology (PCR, qPCR, extraction of RNA, synthesis of cDNA, western blot, blue native, gel enzymatic activities and transfection) and cellular (fibroblasts cultures from patients). Based on the results that we obtained, we have been unable to validate functionally identified mutations in FDXR and NDUFS2 genes. On the other hand, we have discarded the variants in NPHP4 and GMDS genes. Relative to patients with Parkinson's disease, we have discarded all the variants found in low coverage in ATP13A2 gene. This allows us to conclude that it is necessary to validate those variants that have low values in terms of coverage, since it may not be present in patients. On the other hand, we have found a variant in PLA2G6 gene on a patient’s brother. The different studies carried on, show us the importance of the specificity of these, depending on each case. The studies that have validated the variants, allow us to reach a final diagnosis.