Estratègia per a la clarificació i purificació d’una proteïna recombinant produïda en llevat

Abstract

Aquest projecte se centra en el desenvolupament d’una vacuna més eficaç i segura contra el virus X, un patogen extremadament virulent que afecta greument la indústria porcina, provocant pèrdues econòmiques importants. L’objectiu principal és purificar una proteïna recombinant immunògena del virus X, utilitzant el llevat Komagataella phaffi com a sistema d’expressió per formar una entitat supramolecular que serveixi de base per a la vacuna. El procés habitual es basa en el cultiu del llevat en un fermentador en discontinu alimentat, amb inducció per metanol sota el control del promotor AOX1 i l’ús d’un vector d’expressió dissenyat per a produir la proteïna de la càpsida viral. Un cop sintetitzada intracel·lularment, la proteïna es recupera mitjançant disrupció cel·lular, clarificació i purificació per cromatografia d’afinitat. Davant les limitacions del procés convencional (terbolesa elevada i el rendiments baixos), s’ha avaluat una nova estratègia de purificació, la tècnica C, basada en l’ús de resina cromatogràfica no empaquetada combinada amb filtració tangencial per integrar la clarificació i captura en un sol pas. Per aquest motiu, es duen a terme diverses proves de concepte inicial per optimitzar-ne les condicions operatives: assajos de condicions de disrupció, diferents condicions de preparació de la resina i incubació amb la mostra i estratègies de clarificació i captura mitjançant un sistema de filtració tangencial i diafiltració. Els resultats mostren que la disrupció és més eficient en la “condició 8” (una sola passada); que la millor captura s’obté amb la resina Nuvia IMAC a raó de 30ml de mostra/ml de resina i incubació O/N a temperatura ambient; i que la TFF amb una membrana PESU de 0,2μm permet recuperar la proteïna amb rendiments comparables al procés convencional, fins i tot en mostres de terbolesa elevada. En conclusió, tot i que aquesta estratègia encara presenta alguns reptes tècnics, es presenta com una alternativa prometedora al mètode de purificació convencional, sent més segura i econòmica, i posant les bases per a futurs ajustos que permetin incrementar el rendiment i puresa de la proteïna Y.

This project focuses on the development of a more effective and safer vaccine against virus X, an extremely virulent pathogen that severely impacts the swine industry, leading to significant economic losses. The main objective is to purify an immunogenic recombinant protein from virus X using the yeast Komagataella phaffii as an expression system, to form a supramolecular entity to serve as the vaccine basis. The standard production process relies on fed-batch cultivation of the yeast in a bioreactor, with methanol induction under the control of the AOX1 promoter and the use of an expression vector designed to produce the viral capsid protein. Once synthesized intracellularly, the protein is recovered through cell disruption, clarification, and purification by affinity chromatography. Given the limitations of the conventional process (such as high turbidity and low yields), a novel purification strategy— referred to as technique C—has been evaluated. This approach is based on the use of unpacked chromatographic resin combined with tangential flow filtration (TFF), allowing clarification and capture to be integrated into a single step. To optimize the operating conditions, several proof-of concept experiments were conducted: tests of cell disruption conditions, resin preparation and incubation parameters, and clarification/capture strategies using TFF and diafiltration systems. The results show that disruption is most efficient under "condition 8" (a single pass); that the best capture is achieved using Nuvia IMAC resin at a ratio of 30 mL sample per mL of resin with overnight incubation at room temperature; and that TFF with a 0.2 µm PESU membrane allows recovery of the protein with yields comparable to the conventional process, even with high turbidity samples. In conclusion, although this strategy still presents some technical challenges, it emerges as a promising alternative to traditional purification methods—safer, more cost-effective, and laying the groundwork for future optimization to improve yield and purity of protein Y.