ALOX 5 as a CSC-specific target in Breast Cancer

Abstract

El càncer de mama és el segon més comú en la població mundial, però els tractaments quimioterapèutics actuals han mostrat reaccions adverses i fenòmens de multiresistència, essent aquest últim principalment degut a l’existència d’una població de Cancer Stem Cells (CSCs). Per tant, l’objectiu d’aquest projecte ha estat testar un inhibidor especific (siRNA) del gen ALOX5 per veure l’efecte que té en les CSCs. Per tal d’obtenir candidats adequats, es va utilitzar high-throughput screening comparant CSC amb no-CSC. Diversos candidats van ser escollits per a ser validats per PCR quantitativa, dels quals l’araquidonat 5-lipoxigenasa (ALOX5) va ser escollit com la diana més prometedora per a dissenyar una teràpia contra les CSCs. El mètode utiltizat per identificar les CSCs es mitjançant la separació cel·lular per un reporter gene (tdTomato) sota l’expressió d’un marcador establert de CSCs. D’aquesta manera es podia evaluar si després dels tractaments hi havia canvis significatius en el percentatge de CSCs. Un dels punts de partida va ser testar un quimioterapèutic com el paclitaxel (PTX) per veure l’efecte que produïa en les CSCs. Seguidament es va testar l’efecte combinat del paclitaxel amb el siRNA del gen ALOX5 comprovant els percentages de CSCs al final de l’experiment. L’assaig de mamosferes permet testar si el silenciament té un efecte sobre la supervivència de les CSCs. També es va testar l’eficiència d’internalització de les nanoparticles per mitjà del microscòpi confocal. Els resultats d’aquest treball mostren com els tractaments de quimioteràpia convencionals tenen un efecte en les non-CSCs però no en les CSC. Després de tractar les cèl·lules de càncer de mama amb paclitaxel sempre hi ha un augment relatiu del percentatge de CSCs. L’experiment que combina el PTX amb el siALOX5 mostra que, la presència del siRNA evita l’augment relatiu del nombre de CSCs observat quan només hi ha l’efecte del PTX. Un cop normalitzats els replicats, no hi ha diferències significatives entre els percentatges de CSCs. No és pot descartar ALOX5 com a diana per les CSCs en l’assaig de mamosferes el silenciament d’aquest gen té un efecte en la supervivència de les CSCs en dues línes de càncer de mama. L’assaig d’internalització de les nanoparticles mostra un alta eficència d’internalització al citoplasma, però també hi ha agreggació en els lisosomes. Aquesta agregació és un problema atès que les condicions d’aquest orgànul poden degradar el siRNA.

Breast cancer is the second most common cancer in the overall world population, but its actual chemotherapeutic treatment has shown adverse effects and multi-resistance phenomena, being this last due mainly to the existence of a Cancer Stem Cells (CSC) population within the tumor. Thus, the aim of this project has been to test an ALOX5 inhibitor to test the impact on CSCs behaviour, as well as the internalitzation of a potencial nanocarriers for drug delivery, Several candidates were chosen to be validated through quantitative PCR, from which arachidonate 5-lypoxigenase (ALOX5) was chosen as the most promising candidate to target CSC. The methodology used to identify CSCs is based on the detection of a reporter gene (tdTomato) under the expression of a well-established CSC promotor, by cell sorting. This model allows to detect changes in CSCs percentatge. The first step was to test quimiotherapeutic agent (paclitaxel) in order to determine the effect in CSCs population. The second step was to design an experiment that combines paclitaxel and siALOX5 at different point times and analyze the CSCs percentatge. Mammospehere assay was another experiment to check survival of CSCs. To design a new specific nanomedicine with an inhibitor of ALOX5 Internalitzation assays with nanoparticles was carry on to monotorize the ubication of it. The results showed that conventional therapeutic agents did not affect CSCs population but it affects non-CSCs. According to this result, paclitaxel is a good choice to reduce bulk tumor. After treating cells with paclitaxel the percentatge there is a relative increase of CSCs, this is because paclitaxel only affects non-CSCs. The results from assay that combines PTX and siALOX5 showed that the presence of siALOX5 impairs the relative increased observed only with PTX. Normalized data did not show significant differences between siC and untreated samples but this results are not enough descart ALOX5 as a CSCs target because mammospehre assay showed that silencing of ALOX5 have an effect on CSCs survival in a two diferent breast cancer cell lines. Internalitzation assays of nanoparticles showed high internalitzation efficency in citoplasm, as well as an aggregation in lisosomes. This aggregation is a probem because siRNA is degradate due tu de conditions of lisosomes, such us acid pH.